分析细胞株杨梅树皮有效成分抗肿瘤活性体外

论文导读：
摘要：杨梅(Myrica rubra Sieb. et Zucc)是杨梅科杨梅属水果,喜湿、耐阴寒,为我国主要果树之一。杨梅树皮中含有多酚、黄酮、二芳基庚烷、单宁、三萜等具有多种药理活性的化合物。本论文采取人肝癌细胞(HepG2)、人膀胱癌细胞(YTS-1)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)、人前列腺癌细胞(PC-3)等典型的肿瘤细胞株进行体外培养,探讨了杨梅树皮提取物和其主要特点性成分(杨梅素、杨梅苷等)的抗癌活性,发现它们普遍具有良好的抑制肿瘤细胞体外增殖的活性和诱导肿瘤细胞凋亡的作用,尤其是杨梅素与杨梅苷联用在PC-3细胞上体现出极显著的协同增效作用,确定了二者配合的最佳比例联系,并对其协同作用机制进行了探讨。同时,在B16细胞的试验探讨中,杨梅苷体现出可与熊果苷媲美的美白潜力。主要探讨结论如下：(1)杨梅树皮醇提物经由正丁醇萃取得到正丁醇分级相(BuE)和水分级相(WaE),分别测定了两相的多酚、总黄酮含量(W/%)。WaE中多酚和总黄酮含量分别为36.01%±0.8148%、33.15%±0.7374%,BuE中的多酚和总黄酮含量分别为61.01%±0.1165%、31.20%+0.7987%。通过DPPH自由基清除实验,结果表明WaE和BuE的半抑制浓度(IC5o)分别为164.8μg/mL、114.8μg/mL。通过高效液相色谱法浅析,鉴定BuE中主要成分为杨梅素、杨梅苷和槲皮素,并测得BuE中杨梅素、杨梅苷和槲皮素的含量(W/%)分别为3.75%±0.58%、29.28%±1.27%、6.06%+0.355%,摩尔比为1：5.35：1.7。(2)对人肝癌细胞HepG2的体外抑制试验发现,BuE具有较强的细胞增殖抑制作用。在杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷(1：1摩尔比)三组试样中,杨梅苷的效果最弱。培养24h时,杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷对HepG2内细胞增殖的IC5o分别为841.03μmol/L、1578.13μmol/L、652.79μmol/L;培养48h时,三者的IC5o分别为321.67μmol/L、908.20μmol/L、286.92μmol/L,而同期BuE的IC50为116.54μmol/L;培养72h时,杨梅素与杨梅苷联用的抑制效果略高于单独利用杨梅素(浓度为300μmol/L时抑制率分别为52.88%、48.82%),未体现出显著论文导读：
的协同增效作用,而此时BuE的IC50达到80.05μmol/L;表明杨梅树皮有效成分对HepG2细胞的增殖抑制具有时间依赖联系。同时,通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测,表明三组试样能诱导HepG2细胞的凋亡,并呈现剂量依赖联系；高浓度(300μmol/L)时,杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷的诱导细胞凋亡率分别为38.04%、13.77%、38.67%；杨梅素与杨梅苷联用对细胞的早期诱导凋亡作用较强,单独利用杨梅素则对细胞的晚期诱导凋亡作用较强。(3)对人膀胱癌细胞YTS-1的体外增殖抑制试验表明,培养48h时,杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷的IC50分别为240.10μmol/L、272.05μmol/L、378.82μmol/L;培养72h时,IC50分别为198.95μmol/L、209.15μmol/L、251.06μmol/L,表明三组试样对YTS-1细胞的增殖抑制作用均具有时间依赖性,杨梅素与杨梅苷联用并未体现出协同增效作用。同时,采取PI染色法对YTS-1进行细胞周期检测,发现高浓度(300μmol/L)时,三组试样对YTS-1细胞的G2/M期具有显著的阻滞作用(P0.01)。另外,在诱导YTS-1细胞凋亡的试验中发现,低浓度(37.5μmol/L)寸三组样品对YTS-1细胞的诱导凋亡作用不强,而高浓度(300μmol/L)时,作用极显著(P0.01),杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷对YTS-1的诱导细胞凋亡率分别达31.70%、25.50%、25.19%；且杨梅素的早期诱导凋亡作用较强,杨梅素与杨梅苷联用的晚期诱导凋亡作用较强。(4)以公认的天然美白物质熊果苷为阳性对照,对小鼠黑色素瘤细胞(B16)进行细胞增殖抑制试验。发现培养48h时,杨梅素、杨梅苷、熊果苷对B16细胞的IC50分别为131.55μmol/L、138.44μmol/L、154.03μmol/L;培养72h时IC50分别达90.4μmol/L、88.6μmol/L、101.55μmol/L,体现出时间依赖性。同时,通过对B16细胞内酪氨酸酶活性的检测发现,杨梅苷对胞内酪氨酸酶活性的抑制率高达(74.52+3.248)%；对B16细胞内黑色素含量的检测发现,杨梅苷抑制黑色素合成的作用显著；表明杨梅廿的美白效果可与熊果苷媲美。(5)对人前列腺癌细胞PC-3的细胞增殖抑制试验论文导读：试验中,杨梅素和杨梅苷体现出显著的协同增效作用,且二者复配的最佳浓度范围与其在杨梅树皮醇提物正丁醇分级相(BuE)中有着的比上一页123456下一页
发现,培养48h时,杨梅素、杨梅苷和槲皮素对PC-3细胞增殖的IC50分别为94.48μmol/L、267.1μmol/L、418.25μmol/L,BuE和WaE的IC50则为95.21μmol/L和118.3μmol/L;在探讨杨梅素与杨梅苷协同作用试验中,培养48h时,试样浓度75μmol/L的杨梅素、杨梅苷、杨梅素+杨梅苷(各自为37.5μmol/L)对PC-3细胞株的增殖抑制率分别为40.53%、13.34%、72.28%,杨梅素和杨梅苷之间具有协同增效作用。采取吖啶橙染色法浅析,不同给药浓度的PC-3细胞呈现凋亡样变化,并体现出时间与剂量的依赖联系。通过Annexin V-FITC/PI双染法检测,确认杨梅素和杨梅苷能够诱导PC-3细胞凋亡,且杨梅素的作用更强；杨梅素诱导PC-3细胞晚期凋亡的作用较强,而杨梅苷诱导细胞早期凋亡的作用较强；同时,二者体现出显著的协同增效作用。(6)对杨梅素与杨梅苷在PC-3细胞体外增殖抑制试验中的协同增效作用进行进一步探讨,发现杨梅素与杨梅苷对PC-3细胞株的增殖抑制有着时间和剂量依赖联系,培养72h时,杨梅素与杨梅苷联用的作用最强,最佳摩尔浓度比为1：5。通过PI染色法检测PC-3细胞周期,发现杨梅素、杨梅苷都能将PC-3细胞周期阻滞于G0/G1期,且杨梅素与杨梅苷联用对PC-3细胞周期的影响最强,二者的最佳摩尔浓度比为1：5。对PC-3细胞凋亡作用的探讨还表明,低浓度时(75μmol/L)杨梅素、杨梅苷的细胞诱导凋亡作用都不强,而在摩尔比为1：5和1：7时诱导细胞凋亡的作用显著(细胞凋亡比例分别为32.00%、33.30%)。和单独利用杨梅苷时的早期诱导凋亡作用较强相比,摩尔比1：7时虽然杨梅苷的比例增加,其晚期凋亡作用却较强,由此可以推断杨梅素与杨梅苷联用时对PC-3细胞的诱导凋亡作用机制被转变。同时,通过TUNEL法进一步浅析细胞晚期凋亡表明杨梅素与杨梅苷之间具有显著的协同增效作用,二者摩尔比浓度为1：5和1：7时诱导PC-3细胞晚期凋亡的作用较强。综上所述,杨梅树皮提取物及其特性成分杨梅素和杨梅苷对所试的多种肿瘤细胞株的体外增殖均表明出显著的抑制活性及选择性；尤其是在对PC-3细胞的增殖抑制试验中,杨梅素和杨梅苷体现出显著的协同增效作用,且二者复配的最佳浓度范围与其在杨梅树皮醇提物正丁醇分级相(BuE)中有着的比论文导读：人员哦。摘要4-7Abstract7-18第一章概论18-311.1杨梅18-211.1.1杨梅介绍18-191.1.2杨梅树皮、杨梅叶以及杨梅果核的化学组成及功能探讨19-201.1.3杨梅产业的进展近况20-211.1.4杨梅的开发利用展望211.2杨梅树皮的功能性组分及药理作用21-251.2.1杨梅树皮中的多酚、黄酮类
例联系相吻合,以另一侧面印证了杨梅树皮醇提物正丁醇分级相(BuE)对多种肿瘤细胞的抑制活性优于分离得到的单体化合物,表明杨梅树皮有效成分的抗肿瘤活性是以黄酮类化合物为主导的,且黄酮类化合物之间的协同增效作用值得引起高度关注。本探讨结果充分表明,杨梅树皮有效成分在天然抗癌药物、肿瘤防护的功能性食品以及美白护肤品领域具有广阔的运用前景和深入探讨的价值。关键词：杨梅树皮提取物论文杨梅黄酮论文杨梅素论文杨梅苷论文肿瘤细胞株论文体外抑制作用论文细胞凋亡论文协同增效作用论文
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Abstract7-18
第一章 概论18-31

1.1 杨梅18-21

1.1 杨梅介绍18-19

1.2 杨梅树皮、杨梅叶以及杨梅果核的化学组成及功能探讨19-20

1.3 杨梅产业的进展近况20-21

1.4 杨梅的开发利用展望21

1.2 杨梅树皮的功能性组分及药理作用21-25

1.2.1 杨梅树皮中的多酚、黄酮类物质21-22

1.2.2 杨梅树皮中多酚类物质的药理活性22-24

1.2.3 黄酮类化合物抑制肿瘤细胞的体外探讨近况24-25

1.3 全球癌症的高发近况及走势25-27

1.4 癌症的预防和治疗27-29

1.4.1 手术治疗27

1.4.2 化学治疗27-28

1.4.3 放射线治疗28-29

1.4.4 免疫疗法29

1.4.5 癌症的预防29

1.5 本课题的目的和作用29-31

第二章 杨梅树皮有效物质的分离纯化及特点性成分探讨31-43

2.1 引言31

2.2 材料与策略31-34

2.1 试剂、材料和仪器31-32

2.2 杨梅树皮有效成分的分离纯化32

2.3 多酚含量的测定32

2.4 黄酮含量的测定32-33

2.5 高效液相色谱法测定杨梅树皮提取物的有效成分33

2.6 清除DPPH自由基的能力测定33-34

2.3 结果与浅析34-41

2.3.1 多酚和黄酮含量的测定结果34-35

2.3.2 杨梅树皮提取物中有效成分的高效液相色潽法测定35-40

2.3.3 对DPPH自由基的清除能力40-41

2.4 讨论41

2.5 结论41-43

第三章 杨论文导读：.1材料、试剂和仪器56-574.2.2细胞培养574.2.3细胞增殖浅析574.2.4PI染色法测定细胞周期574.2.5AnnexinV-FITC/PI双染色法测定细胞诱导凋亡57-584.2.6数据浅析584.3结果58-664.3.1杨梅黄酮对YTS-1细胞增殖的抑制作用58-614.3.2PI染色测定细胞周期61-634.3.3AnnexinV-FITC/PI染色测定细胞凋亡63-664.4讨论664.5
梅树皮有效成分对人肝癌细胞株HepG2的体外抑制作用探讨43-56

3.1 引言43-44

3.2 材料与策略44-46

3.

2.1 试剂、材料和仪器44-45

3.

2.2 细胞冻存、复苏及细胞培养45

3.

2.3 细胞增殖浅析45

3.

2.4 Annexin V-FITC/PI双染色法测定细胞诱导凋亡45-46

3.

2.5 数据浅析46

3.3 结果与浅析46-53

3.1 杨梅黄酮对HepG2细胞增殖的抑制作用46-50

3.2 Annexin V-FITC/PI染色测定细胞凋亡50-53

3.4 讨论53-54

3.5 结论54-56

第四章 杨梅树皮有效成分对人膀胱癌细胞YTS-1的体外抑制作用探讨56-68

4.1 引言56

4.2 材料与策略56-58

4.

2.1 材料、试剂和仪器56-57

4.

2.2 细胞培养57

4.

2.3 细胞增殖浅析57

4.

2.4 PI染色法测定细胞周期57

4.

2.5 Annexin V-FITC/PI双染色法测定细胞诱导凋亡57-58

4.

2.6 数据浅析58

4.3 结果58-66
4.

3.1 杨梅黄酮对YTS-1细胞增殖的抑制作用58-61

4.

3.2 PI染色测定细胞周期61-63

4.

3.3 Annexin V-FITC/PI染色测定细胞凋亡63-66

4.4 讨论66

4.5 结论66-68

第五章 杨梅树皮有效成分对黑色素瘤细胞B16的体外抑制效果及美白作用探讨68-76

5.1 引言68-69

5.2 材料与策略69-70

5.

2.1 材料、试剂和仪器69

5.

2.2 细胞培养69

5.

2.3 细胞增殖浅析69

5.

2.4 酪氨酸酶活性抑制测定69-70

5.

2.5 黑色素含量测定70

5.

2.6 数据浅析70

5.3 结果70-74
5.

3.1 杨梅黄酮对B16细胞增殖的抑制作用70-72

5.

3.2 酪氨酸酶活性抑制测定72-73

5.

3.3 黑色素抑制测定73-74

5.4 讨论74-75

5.5 结论75-76

第六章 杨梅树皮有效成分成分对人前列腺癌细胞PC-3的体外抑制作用探讨76-92

6.1 引言76-77

6.2 材料与策略77-78

6.

2.1 材料、试剂和仪器77

6.

2.2 细胞培养77

6.

2.3 细胞增殖浅析77

6.

2.4 吖啶橙染色浅析77-78

6.

2.5 细胞凋亡检测78

6.

2.6 数据浅析78

6.3 结果与浅析78-88
6.

3.1 杨梅黄酮对PC-3细胞增殖的抑论文导读：一页123456

制作用78-83
6.

3.2 吖啶橙染色浅析83-86

6.

3.3 Annexin V-FITC/PI染色测定细胞凋亡86-88

6.4 讨论88-90

6.5 小结90-92

第七章 杨梅黄酮抑制PC-3和YTS-1细胞的协同作用探讨92-110

7.1 引言92

7.2 材料与策略92-95

7.

2.1 材料、试剂和仪器92

7.

2.2 细胞培养92-93

7.

2.3 细胞增殖浅析93

7.

2.4 PI染色法测定细胞周期93

7.

2.5 细胞凋亡检测93

7.

2.6 TUNEL法浅析细胞凋亡93-95

7.

2.7 数据浅析95

7.3 结果95-106
7.

3.1 杨梅黄酮对YTS-1和PC-3细胞增殖的抑制作用95-98

7.

3.2 PI染色法测定细胞周期98-100

7.

3.3 Annexin V-FITC/PI染色测定细胞凋亡100-103

7.

3.4 TUNEL法浅析细胞凋亡103-106

7.4 讨论106-109

7.5 结论109-110

第八章 总结与展望110-114
8.1 总结110-112
8.2 展望112-114
参考文献114-131
攻读博士期间主要的科研成果131-132
致谢132