浅论阿尔新型抗癫痫药对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠病理学与行为学影响及机制
最后更新时间：2024-02-11
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论文导读：
摘要：随着全球老龄化的到来，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）患者人群及相关的经济负担剧增，已经成为不容忽略的公共卫生事件。AD主要临床体现为渐行性、全面性认知功能减退，主要病理特点为脑内淀粉样蛋白β（AmyloidBeta，Aβ）的沉积及神经原纤维缠结。目前尚缺乏有效的治疗办法来阻止或逆转该病的发展。探讨发现AD患者及AD高危人群的神经网络兴奋性显著增高。而来自不同探讨团队的多项基础探讨均提示，Aβ极为相关上游分子的异常表达能影响AD转基因动物模型的神经网络兴奋性，另一方面，异常的神经网络兴奋性可能导致Aβ相关的病理及认知损害。抗癫痫药物对神经网络兴奋性的调节意义已在多种不同疾病的动物模型中得到验证，包括AD、癫痫及衰老等。传统抗癫痫药物丙戊酸（Valproic acid，VPA）明显改进了AD转基因小鼠的病理与记忆损害，其机制除了对神经网络兴奋性的调节外，还与抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的活性有关。探讨发现，常用的新型抗癫痫药物中，托吡酯（topiramate，TPM）与左乙拉西坦（Levetiracetam，LEV）均具有HDAC抑制意义。而目前关于新型抗癫痫药物TPM及LEV对AD转基因模型病理与行为的影响及分子机制探讨较少。调节神经网络兴奋性与HDAC活性已成为AD治疗的新对策。既然新型抗癫痫药TPM及LEV能调节神经网络兴奋性与HDAC活性，那么我们提出从下两个不足：（1）新型抗癫痫药TPM及LEV能否改进AD转基因模型的病理与记忆损害？（2）新型抗癫痫药TPM及LEV对AD核心病理分子Aβ的清除及产生途径有何影响？其中的分子机制包括哪些？拟通过上面陈述的探讨验证新型抗癫痫药TPM及LEV对AD转基因动物模型的保护意义，为AD的治疗对策拓宽思路。第一部分新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠病理学与行为学的影响目的：探讨TPM与LEV对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠病理学与行为学的影响。办法与材料：选取7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠（体重约20-25克），分为阴性对照组（Ctrl）、TPM组、LEV组及阳性对照VPA组，每组10只；各组分别腹腔注射20mg/Kg TPM、50mg/Kg LEV、30mg/Kg VPA，阴性对照组注射同等体积的生理盐水，每日一次，持续30天。选用7月龄C57BL/6J小鼠作为非转基因对照。免疫组化技术（Aβ1-42）及硫磺素染色评估抗癫痫药物对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响，Western blotting评估抗癫痫药物对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内tau蛋白异常磷酸化的影响，Morris水迷宫实验评估抗癫痫药物对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习记忆能力的影响。结果：与同龄野生型C57BL/6J小鼠相比，7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠大脑皮质及海马区有大量Aβ沉积。在隐蔽平台实验中，其登台潜伏期、所游行的距离显著延长；在空间探索实验中，穿越原隐藏平台所在象限的次数显著减少。TPM、LEV明显减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积，降低tau蛋白异常磷酸化水平。在隐蔽平台实验中，TPM、LEV明显降低APPswe/PS1dE9双转基因小鼠登台潜伏期、所游行的距离；在空间探索实验中，TPM、LEV明显增多其穿越原平台所在象限的次数。结论：7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠大脑皮层及海马区有大量Aβ沉积，有着tau蛋白异常磷酸化；同时，伴有显著的学习、记忆能力损害。新型抗癫痫药TPM、LEV能明显减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积及tau蛋白异常磷酸化，明显改进其学习、记忆能力。第二部分新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Aβ清除与产生途径的影响及分子机制目的：探讨TPM与LEV对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Aβ清除与产生途径的影响及分子机制。办法与材料：选取7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠（体重约20-25克），按分组分别腹腔注射20mg/Kg TPM、50mg/Kg LEV、30mg/Kg VPA，阴论文导读：
性对照组腹腔注射同等体积的生理盐水，每日一次，持续30天。体外探讨中，选择人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y作为探讨对象，分为阴性对照组（Ctrl）、TPM组（0.25mM）、LEV（0.25mM）及阳性对照VPA（1.0mM）。ELISA检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及外周血Aβ1-42浓度，Western blotting检测各组脑组织中低密度脂蛋白受体相关蛋白1（Low density ppoproteinreceptor-related protein1，LRP1）、晚期糖基化终产物受体（receptor for advancedglycosylation end products， RAGE）的表达； Western blotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中微管相关蛋白轻链3（Microtubule-associated protein pght chain3，LC3）、Becpn1的表达；Westernblotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、β位淀粉样前体蛋白裂解酶1（beta-site APP cleing enzyme1，BACE1）、淀粉样前体蛋白羧基末端片段（amyloid precursor protein carboxy terminal fragments，APP-CTFs）的表达；Western blotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、AMP激活的蛋白激酶α （AMP-activated proteinkinase，AMPKα）磷酸化（p-GSK-3β（Ser9）、p-Ak（tSer473）、p-AMPKα（Ser172））的表达；Western blotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中组蛋白H4乙酰化（acetylated histone H4，Acetyl-H4（Lys5））的表达。结果：TPM、LEV明显降低APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织Aβ1-42的浓度，增多外周血Aβ1-42的浓度，同时，上调脑组织中LRP1的表达；TPM、LEV明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株LC3、Becpn1的表达；TPM、LEV明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株p-GSK-3β（Ser9）、p-Akt（Ser473）、p-AMPKα（Ser172）的表达；TPM、LEV明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株Acetyl-H4（Lys5）的表达。结论：新型抗癫痫药TPM、LEV明显减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积的机制可能包括：（1）推动血脑屏障转运Aβ的能力及自噬；（2）抑制γ分泌酶的活性减少Aβ的产生。TPM、LEV推动自噬及抑制γ分泌酶可能通过调控Akt与AMPKα的磷酸化而抑制GSK-3β的活性。TPM、LEV可能抑制了APPswe/PS1dE9双转基因鼠HDAC的活性。综上所述，本探讨的主要创新之处在于：1.新型抗癫痫药TPM、LEV明显改进APPswe/PS1dE9双转基因小鼠神经病理及学习记忆能力损害新型抗癫痫药TPM、LEV能明显减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积及tau蛋白异常磷酸化，明显改进其学习、记忆能力。该结果为AD发病机制的“神经网络兴奋性异常”假说提供依据，提示“异常的神经网络兴奋性”可能为AD药物研发的潜在靶点。2.新型抗癫痫药TPM、LEV调节Aβ清除及产生途径新型抗癫痫药TPM、LEV能推动血脑屏障转运Aβ的能力及自噬，抑制γ分泌酶的活性减少Aβ的产生；分子机制可能与其抑制HDAC活性及抑制GSK3β活性有关。该结果提示HDAC为干预AD的潜在靶点。论文导读：
关键词：阿尔茨海默病论文新型抗癫痫药物论文β淀粉样蛋白论文神经病理论文记忆损害论文
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中文摘要7-12
ABSTRACT12-17
前言17-26
第一部分 新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对 APPswe/PS1dE9 双转基因小鼠病理学与行为学的影响26-54
引言26-27
材料与办法27-45
结果45-51
讨论51-53
结论53-54
第二部分 新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对 APPswe/PS1dE9 双转基因小鼠Aβ清除与产生途径的影响及分子机制54-75
引言54-55
材料与办法55-60
结果60-71
讨论71-74
结论74-75
结语75-78
参考文献78-90
综述90-106
参考文献98-106
攻读学位期间发表文章106-108
致谢108-109
摘要：随着全球老龄化的到来，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）患者人群及相关的经济负担剧增，已经成为不容忽略的公共卫生事件。AD主要临床体现为渐行性、全面性认知功能减退，主要病理特点为脑内淀粉样蛋白β（AmyloidBeta，Aβ）的沉积及神经原纤维缠结。目前尚缺乏有效的治疗办法来阻止或逆转该病的发展。探讨发现AD患者及AD高危人群的神经网络兴奋性显著增高。而来自不同探讨团队的多项基础探讨均提示，Aβ极为相关上游分子的异常表达能影响AD转基因动物模型的神经网络兴奋性，另一方面，异常的神经网络兴奋性可能导致Aβ相关的病理及认知损害。抗癫痫药物对神经网络兴奋性的调节意义已在多种不同疾病的动物模型中得到验证，包括AD、癫痫及衰老等。传统抗癫痫药物丙戊酸（Valproic acid，VPA）明显改进了AD转基因小鼠的病理与记忆损害，其机制除了对神经网络兴奋性的调节外，还与抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的活性有关。探讨发现，常用的新型抗癫痫药物中，托吡酯（topiramate，TPM）与左乙拉西坦（Levetiracetam，LEV）均具有HDAC抑制意义。而目前关于新型抗癫痫药物TPM及LEV对AD转基因模型病理与行为的影响及分子机制探讨较少。调节神经网络兴奋性与HDAC活性已成为AD治疗的新对策。既然新型抗癫痫药TPM及LEV能调节神经网络兴奋性与HDAC活性，那么我们提出从下两个不足：（1）新型抗癫痫药TPM及LEV能否改进AD转基因模型的病理与记忆损害？（2）新型抗癫痫药TPM及LEV对AD核心病理分子Aβ的清除及产生途径有何影响？其中的分子机制包括哪些？拟通过上面陈述的探讨验证新型抗癫痫药TPM及LEV对AD转基因动物模型的保护意义，为AD的治疗对策拓宽思路。第一部分新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠病理学与行为学的影响目的：探讨TPM与LEV对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠病理学与行为学的影响。办法与材料：选取7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠（体重约20-25克），分为阴性对照组（Ctrl）、TPM组、LEV组及阳性对照VPA组，每组10只；各组分别腹腔注射20mg/Kg TPM、50mg/Kg LEV、30mg/Kg VPA，阴性对照组注射同等体积的生理盐水，每日一次，持续30天。选用7月龄C57BL/6J小鼠作为非转基因对照。免疫组化技术（Aβ1-42）及硫磺素染色评估抗癫痫药物对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响，Western blotting评估抗癫痫药物对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内tau蛋白异常磷酸化的影响，Morris水迷宫实验评估抗癫痫药物对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习记忆能力的影响。结果：与同龄野生型C57BL/6J小鼠相比，7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠大脑皮质及海马区有大量Aβ沉积。在隐蔽平台实验中，其登台潜伏期、所游行的距离显著延长；在空间探索实验中，穿越原隐藏平台所在象限的次数显著减少。TPM、LEV明显减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积，降低tau蛋白异常磷酸化水平。在隐蔽平台实验中，TPM、LEV明显降低APPswe/PS1dE9双转基因小鼠登台潜伏期、所游行的距离；在空间探索实验中，TPM、LEV明显增多其穿越原平台所在象限的次数。结论：7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠大脑皮层及海马区有大量Aβ沉积，有着tau蛋白异常磷酸化；同时，伴有显著的学习、记忆能力损害。新型抗癫痫药TPM、LEV能明显减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积及tau蛋白异常磷酸化，明显改进其学习、记忆能力。第二部分新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Aβ清除与产生途径的影响及分子机制目的：探讨TPM与LEV对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Aβ清除与产生途径的影响及分子机制。办法与材料：选取7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠（体重约20-25克），按分组分别腹腔注射20mg/Kg TPM、50mg/Kg LEV、30mg/Kg VPA，阴论文导读：
性对照组腹腔注射同等体积的生理盐水，每日一次，持续30天。体外探讨中，选择人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y作为探讨对象，分为阴性对照组（Ctrl）、TPM组（0.25mM）、LEV（0.25mM）及阳性对照VPA（1.0mM）。ELISA检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及外周血Aβ1-42浓度，Western blotting检测各组脑组织中低密度脂蛋白受体相关蛋白1（Low density ppoproteinreceptor-related protein1，LRP1）、晚期糖基化终产物受体（receptor for advancedglycosylation end products， RAGE）的表达； Western blotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中微管相关蛋白轻链3（Microtubule-associated protein pght chain3，LC3）、Becpn1的表达；Westernblotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、β位淀粉样前体蛋白裂解酶1（beta-site APP cleing enzyme1，BACE1）、淀粉样前体蛋白羧基末端片段（amyloid precursor protein carboxy terminal fragments，APP-CTFs）的表达；Western blotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、AMP激活的蛋白激酶α （AMP-activated proteinkinase，AMPKα）磷酸化（p-GSK-3β（Ser9）、p-Ak（tSer473）、p-AMPKα（Ser172））的表达；Western blotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中组蛋白H4乙酰化（acetylated histone H4，Acetyl-H4（Lys5））的表达。结果：TPM、LEV明显降低APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织Aβ1-42的浓度，增多外周血Aβ1-42的浓度，同时，上调脑组织中LRP1的表达；TPM、LEV明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株LC3、Becpn1的表达；TPM、LEV明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株p-GSK-3β（Ser9）、p-Akt（Ser473）、p-AMPKα（Ser172）的表达；TPM、LEV明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株Acetyl-H4（Lys5）的表达。结论：新型抗癫痫药TPM、LEV明显减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积的机制可能包括：（1）推动血脑屏障转运Aβ的能力及自噬；（2）抑制γ分泌酶的活性减少Aβ的产生。TPM、LEV推动自噬及抑制γ分泌酶可能通过调控Akt与AMPKα的磷酸化而抑制GSK-3β的活性。TPM、LEV可能抑制了APPswe/PS1dE9双转基因鼠HDAC的活性。综上所述，本探讨的主要创新之处在于：1.新型抗癫痫药TPM、LEV明显改进APPswe/PS1dE9双转基因小鼠神经病理及学习记忆能力损害新型抗癫痫药TPM、LEV能明显减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积及tau蛋白异常磷酸化，明显改进其学习、记忆能力。该结果为AD发病机制的“神经网络兴奋性异常”假说提供依据，提示“异常的神经网络兴奋性”可能为AD药物研发的潜在靶点。2.新型抗癫痫药TPM、LEV调节Aβ清除及产生途径新型抗癫痫药TPM、LEV能推动血脑屏障转运Aβ的能力及自噬，抑制γ分泌酶的活性减少Aβ的产生；分子机制可能与其抑制HDAC活性及抑制GSK3β活性有关。该结果提示HDAC为干预AD的潜在靶点。论文导读：
关键词：阿尔茨海默病论文新型抗癫痫药物论文β淀粉样蛋白论文神经病理论文记忆损害论文
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中文摘要7-12
ABSTRACT12-17
前言17-26
第一部分 新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对 APPswe/PS1dE9 双转基因小鼠病理学与行为学的影响26-54
引言26-27
材料与办法27-45
结果45-51
讨论51-53
结论53-54
第二部分 新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对 APPswe/PS1dE9 双转基因小鼠Aβ清除与产生途径的影响及分子机制54-75
引言54-55
材料与办法55-60
结果60-71
讨论71-74
结论74-75
结语75-78
参考文献78-90
综述90-106
参考文献98-106
攻读学位期间发表文章106-108
致谢108-109