试述基因复方黄连注射剂对金葡球菌MSW和耐药基因影响集

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摘要：金葡菌特别是耐药金葡菌对人类和动物导致的耐药已经成为了临床治疗中最棘手不足,本论文探讨了复方黄连注射剂对敏感型金葡菌突变选择窗以及对耐药金葡菌gyrA基因序列和NorA基因表达的影响,为该注射剂作为中药复方耐药抑制剂开发提供一定的探讨基础。本论文的第一部分采取MH琼脂倍比稀释法测定β-内酰胺类药物(阿莫西林和头孢噻呋)单用及与复方黄连注射剂联合利用对金葡菌ATCC29213的MIC、MIC99和MPC。结果显示,p-内酰胺类药物和复方黄连注射剂联合用药可以显著缩小MSW。阿莫西林单独利用时的SI值为15.2,与16MIC的复方黄连注射剂联合利用后,SI降低至5.1,为其单独用药的1/3；头孢噻呋单独利用时其SI值为16.1,与16MIC的复方黄连注射剂联合利用后,SI降低至4.2,为单独用药的1/4。本论文第二部分通过人工逐步诱导法建立了耐恩诺沙星、氧氟沙星和诺氟沙星的耐药菌株。用倍比稀释法和纸片法对其耐药性进行检测；再用DNA提取试剂盒提取金葡菌敏感菌株ATCC29213、人工诱导的耐恩诺沙星、氧氟沙星和诺氟沙星的耐药菌株和经复方黄连注射剂处理的耐恩诺沙星、氧氟沙星和诺氟沙星的菌株grlA和gyrA基因进行PCR扩增,将其产物与pMD18-T载体进行连接,转化至JM109大肠埃希氏菌感受态细胞,筛选阳性克隆,测序。测序结果浅析表明,人工诱导的耐恩诺沙星、氧氟沙星和诺氟沙星的耐药菌株grlA和gyrA碱基序列和氨基酸序列都发生了突变；经过复方黄连注射剂处理后,grlA和gyrA基因的碱基和氨基酸序列有显著的回复突变作用,但对诺氟沙星药物诱导产生的耐药菌株没有回突变作用。本论文第三部分采取TRIZOL试剂提取金葡菌敏感菌株、人工诱导耐恩诺沙星、耐氧氟沙星和耐诺氟沙星的耐药菌株和复方黄连注射剂处理的耐恩诺沙星、耐氧氟沙星和耐诺氟沙星的菌株RNA,用荧光定量RT-PCR探讨复方黄连注射剂对NorA基因表达的影响。结果表明,复方黄连注射剂能够降低人工诱导耐恩诺沙星、氧氟沙星和诺氟沙星耐药菌株NorA基因的mRNA表达量。关键词：复方黄连注射剂论文金葡菌论文突变选择窗论文grlA、gyrA基因论文NorA基因表达论文
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摘要4-5
Abstract5-10
第一章 文献综述10-16
1 抗生素防突变浓度和突变选择窗的探讨10-13

1.1 防突变浓度与突变选择窗概念10

1.2 抗生素单独用药防突变浓度和突变选择窗探讨10-11

1.3 抗生素联合用药的防突变浓度和突变选择窗探讨11-12

1.4 防突变浓度和突变选择窗有着的不足12-13

2 耐氟喹诺酮类药物金葡菌的耐药性与grlA、gyrA和NorA基因的联系13-16

2.1 由grlA和gyrA基因点突变引起的耐药14-15

2.2 由NorA基因介导的耐药15-16

第二章 联合用药对金葡菌MSW的影响16-30
1 材料与策略16-21

1.1 材料16-18

1.2 试验策略18-21

2 结果21-27

2.1 阿莫西林单用对金葡菌ATCC29213的MIC和MIC99测定结果21

2.2 头孢噻呋单用对金葡菌ATCC29213的MIC和MIC99、测定结果21-22
2.3 复方黄连注射剂单用对金葡菌ATCC29213的MIC和MIC99测定结果22-23

2.4 阿莫西林单用对金葡菌ATCC29213的MPCpr和MPC测定结果23

2.5 头孢噻呋单用对金葡菌ATCC29213的MPCpr和MPC测定结果23-24
2.6 复方黄连注射剂单用对金葡菌ATCC29213的MPCpr和MPC测定结果24-25
2.7 阿莫西林与复方黄连注射剂联合利用对金葡菌ATCC29213的MPCpr、MPC和SI25-26
2.8 头孢噻呋与复方黄连注射剂联合利用对金葡菌ATCC29213的MPCpr、MPC和SI26-27
3 讨论与浅析27-29
4 结论29-30
第三章 耐氟喹诺酮类金葡菌grlA、gyrA基因突变及复方黄连注射剂对突变的影响30-43
1 材料与策略30-34

1.1 材料30-32

1.1 菌株30

1.2 培养基和配制策略30

1.3 药品30

1.4 主要试剂30-31

1.5 主要仪器31-32

1.2 策略32-34

2 结果34-41

2.1 标准株、人工诱导耐药株菌及经过处理的耐药株MIC测定结果34-35

2.2 抑菌圈直径测定结果35-36

2.3 grlA和gyrA基因的扩增36-38

2.4 PCR产物的回收与克隆后阳性菌株的扩增结果38-39

2.5 grlA和gyrA基论文导读：

因测序与突变浅析39-41
3 讨论41-42

3.1 耐药性诱导株的建立41

3.2 耐药株grlA、gyrA基因碱基突变和氨基酸突变情况浅析41-42

4 结论42-43
第四章 复方黄连注射剂对耐药金葡菌NorA基因表达的影响43-52
1 材料与策略43-46

1.1 材料43-44

1.2 试验策略44-46

2 试验结果46-50

2.1 NorA基因反转录产物琼脂糖凝胶电泳结果46-47

2.3 回收纯化后的PCR产物测序结果47

2.4 NorA基因的实时荧光PCR的结果47-50

3 讨论与浅析50-52
第五章 结论52-53
1 试验结论52
2 本试验的革新点52-53
参考文献53-62
英文缩略语对照表62-63
致谢63-64
作者介绍64-65
附录A：序列比对和氨基酸比对结果65-76