简谈响尾蛇p38MAPK通路在响尾蛇毒素诱导SK-MES-1肺癌细胞凋亡和自噬中作用

论文导读：
摘要：目的：响尾蛇毒素（crotoxin，简称CrTX）是南美响尾蛇Crotalus durissusterrificus毒液的主要毒素，包括一个弱毒性的碱性成分PLA2（CB）和一个无酶活性无毒性的酸性成分（crotapotin，CA），它是一个异二聚体的β-神经毒素。CrTX经典的生物活性包括神经毒性、肌肉毒性、肾毒性和心脏毒性等，近年大量探讨说明它还具有免疫调节、抗炎、抗微生物、镇痛和抗肿瘤等多种作用。多篇文献报道CrTX体内外都具有抗肿瘤活性，但是其分子机制尚未完全阐明。本论文以SK-MES-1肺癌细胞为模型，以体外细胞和分子水平探讨了CrTX的抗肿瘤作用及其机制。策略：首先采取MTT法检测CrTX对SK-MES-1肺癌细胞的细胞毒作用，并采取平板克隆法检测CrTX对SK-MES-1细胞克隆形成能力的影响；采取流式细胞术检测CrTX对细胞周期的影响，Western blot检测PCNA蛋白水平的变化；采取Hoechst33258染色以细胞核形态观察细胞凋亡、Annexin V-FITC/PI双染定量凋亡率，并用Western blot检测Caspase-3蛋白的活性；采取Western blot检测自噬相关蛋白LC3、p62和Becpn1的变化；Western blot检测CrTX给药后P-p38和p38蛋白水平的变化，引入p38MAPK特异性阻断剂SB203580（简称SB），用MTT法检测阻断p38MAPK通路对细胞存活率的影响；采取SB阻断p38MAPK通路，观察对CrTX诱导的细胞周期阻滞、凋亡以及自噬的影响。结果：CrTX显著抑制SK-MES-1肺癌细胞的生长，并呈现浓度和时间依赖性效应，72h的IC50为25.13μg/ml；CrTX处理细胞48h，能显著抑制SK-MES-1肺癌细胞的集落形成能力（p 0.001），并具有浓度依赖性；CrTX能诱导细胞S期阻滞，并导致PCNA蛋白表达下降；CrTX诱导细胞凋亡，凋亡百分率以4.65%±1.73%（阴性对照组）上升到12.44%±0.45%（50μg/ml），Caspase-3活性升高；CrTX诱导自噬，上调LC3和Becpn1蛋白水平并下调p62蛋白水平；CrTX上调P-p38蛋白水平，对p38蛋白水平没有显著影响；SB预处理阻断p38MAPK通路，与单独给予CrTX组相比，细胞存活率上升；SB预论文导读：22.1.1主要试剂及其溶液配制21-222.1.2主要仪器222.2实验策略22-252.2.1FCM检测细胞周期变化22-232.2.2Westernblot检测PCNA蛋白变化23-242.2.3Hoechst33258染色观察细胞核形态242.2.4AnnexinV-FITC/PI双染检测凋亡细胞24-252.2.5Westernbl上一页1234下一页
处理阻断p38MAPK通路，对CrTX诱导的S期阻滞无影响；SB预处理组与单独给予CrTX组相比，能导致细胞凋亡率下降、凋亡相关蛋白Caspase-3活性下调，自噬相关蛋白LC3和Becpn1蛋白水平下调以及p62蛋白水平上调。结论：本论文实验表明CrTX能显著抑制SK-MES-1肺癌细胞的生长增殖，诱导细胞S期阻滞、凋亡以及自噬，激活p38MAPK通路发挥抗肿瘤作用，p38MAPK参与了CrTX诱导的细胞凋亡和自噬，不参与CrTX诱导S期阻滞。关键词：响尾蛇毒素论文p38MAPK论文凋亡论文自噬论文
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Abstract6-11
引言11-17

一、CrTX 抗肿瘤探讨概况12-13

二、细胞周期调控、凋亡、自噬和抗肿瘤13-14

三、p38MAPK 与抗肿瘤14-16

四、本课题探讨的主要内容16-17

第一章 CrTX 对 SK-MES-1 肺癌细胞的生长抑制作用17-21

1.1 实验仪器与试剂17-18

1.1 药物及试剂的配制17

1.2 主要仪器17-18

1.3 细胞株18

1.2 实验策略18-19

1.2.1 细胞培养18

1.2.2 CrTX 对 SK-MES-1 细胞生长抑制作用18

1.2.3 CrTX 对 SK-MES-1 细胞集落形成的影响18-19

1.2.4 统计浅析19

1.3 实验结果19-20

1.3.1 CrTX 对 SK-MES-1 细胞的生长抑制作用19-20

1.3.2 CrTX 对 SK-MES-1 细胞集落形成能力的影响20

1.4 小结与讨论20-21

第二章 CrTX 对细胞周期的影响以及诱导凋亡和自噬的探讨21-32

2.1 实验仪器与试剂21-22

2.

1.1 主要试剂及其溶液配制21-22

2.

1.2 主要仪器22

2.2 实验策略22-25

2.1 FCM 检测细胞周期变化22-23

2.2 Western blot 检测 PCNA 蛋白变化23-24

2.3 Hoechst 33258 染色观察细胞核形态24

2.4 Annexin V-FITC/PI 双染检测凋亡细胞24-25

2.2.5 Western bl论文导读：Caspase-3活性变化252.2.6WesternblLC3蛋白变化252.2.7Westernblp62蛋白变化252.2.8WesternblBecpn1蛋白变化252.2.9统计浅析252.3实验结果25-312.3.1CrTX对SK-MES-1细胞周期的影响25-262.3.2CrTX对PCNA蛋白水平的影响26-272.3.3Hoechst33258染色结果27-282.3.4CrTX对SK-MES-1细胞凋亡率的影响2
ot 检测 Caspase-3 活性变化25

2.6 Western blot 检测 LC3 蛋白变化25

2.7 Western blot 检测 p62 蛋白变化25

2.8 Western blot 检测 Becpn 1 蛋白变化25

2.9 统计浅析25

2.3 实验结果25-31

2.3.1 CrTX 对 SK-MES-1 细胞周期的影响25-26

2.3.2 CrTX 对 PCNA 蛋白水平的影响26-27

2.3.3 Hoechst 33258 染色结果27-28

2.3.4 CrTX 对 SK-MES-1 细胞凋亡率的影响28

2.3.5 CrTX 对 Caspase-3 活性的影响28-29

2.3.6 CrTX 对 LC3 蛋白水平的影响29

2.3.7 CrTX 对 p62 蛋白水平的影响29-30

2.3.8 CrTX 对 Becpn 1 蛋白水平的影响30-31

2.4 小结与讨论31-32

第三章 p38MAPK 途径在 CrTX 抑制细胞生长历程中的作用32-36

3.1 实验仪器与试剂32

3.

1.1 主要试剂32

3.

1.2 主要仪器32

3.2 实验策略32
3.2.1 Western blot 法检测 P-p38 和 p38 蛋白水平的变化32
3.

2.2 SB 预处理对 CrTX 引起的细胞抑制的影响32

3.

2.3 统计浅析32

3.3 实验结果与讨论32-34

3.1 CrTX 对 p38MAPK 途径的影响32-34

3.2 阻断 p38MAPK 途径对细胞存活率的影响34

3.4 小结与讨论34-36

第四章 p38MAPK 途径对 CrTX 诱导周期阻滞、凋亡以及自噬的影响36-43

4.1 实验仪器与试剂36

4.

1.1 主要试剂及其溶液配制36

4.

1.2 主要仪器36

4.2 实验策略36-37
4.

2.1 p38MAPK 对 S 期阻滞的影响36

4.

2.2 p38MAPK 对凋亡率的影响36

4.

2.3 p38MAPK 对 Caspase-3 活性的影响36

4.

2.4 p38MAPK 对 LC3 蛋白水平的影响36

4.

2.5 p38MAPK 对 p62 蛋白水平的影响36-37

4.

2.6 p38MAPK 对 Becpn 1 蛋白水平的影响37

4.

2.7 统计浅析37

4.3 实验结果与讨论37-41
4.3.1 p38MAPK 对 S 期阻滞的影响37-3论文导读：58附录二缩略词表58-60致谢60-61上一页1234
8
4.

3.2 p38MAPK 对凋亡率的影响38

4.

3.3 p38MAPK 对 Caspase-3 活性的影响38-39

4.

3.4 p38MAPK 对 LC3 蛋白水平的影响39-40

4.

3.5 p38MAPK 对 p62 蛋白水平的影响40

4.

3.6 p38MAPK 对 Becpn 1 蛋白水平的影响40-41

4.4 小结与讨论41-43
结论43-44
参考文献44-49
攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文49-50
附录

一、综述50-58

参考文献55-58
附录

二、缩略词表58-60

致谢60-61