浅谈线粒体益肾降浊冲剂干预慢性肾功能衰竭肾小管损伤临床与基础选题

论文导读：号通路的变化。结果：(1)临床探讨部分：两组治疗前临床资料比较差别无统计学作用；两组综合治疗疗效比较,总有效率86.45%,其中显效率33.33%；对照组总有效率56.67%,其中显效率12%,试验组总有效率及显效率均优于对照组,与对照组比较P0.05；两组治疗前血肌酐水平与中医症状总积分呈正相关,GFR与血肌酐水平、尿a1-MG、β2-MG、NGAL及
摘要：探讨背景：脾肾气虚、湿浊内蕴证是慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)3-4期常见的中医证型,转化生长因子-β1(tranorming growth factor-β1, TGF-β1)通过ROS-MAPK信号通路影响线粒体的功能与再生、诱导肾小管上皮细胞凋亡参与肾小管间质纤维化的形成是CKD进展到终末期肾衰的重要机制之一。益肾降浊冲剂(闽药制字Z06106052)是福建中医药大学附属人民医院的院内制剂,临床已经运用于治疗慢性肾功能衰竭(chronic renal failure, CRF)20年。目的：(1)通过临床探讨,观察益肾降浊冲剂对CKD3-4期(体现为“脾肾气虚、湿浊内蕴证”)患者的肾功能、中医临床症状、尿TGF-β1、肾小管损伤的影响；(2)通过基础探讨(动物实验+细胞实验),以细胞超微结构、分子病理、基因、蛋白水平及相关信号通路深入探讨其延缓CRF进展的机制。策略：(1)临床探讨部分：选取符合入选标准的患者,即诊断为慢性肾小球肾炎(CKD3-4期)、中医临床体现为“脾肾气虚、湿浊内蕴”证型的患者,随机分为试验组31例、对照组30例,均在现代医学常规治疗基础上加用中药治疗,试验组予以益肾降浊冲剂冲服(30g/d),对照组予以尿毒清冲服(25g/d)。连续治疗12周后,观察两组治疗前后血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、24h尿蛋白定量、肾小球滤过率(GFR)、中医临床症状评分、尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated ppocapn, NGAL)、β2-微球蛋白(beta-2-microglobupn,β2-MG)、a1-微球蛋白(a1-microglobupn, a1-MG)、尿TGF-β1水平的变化及各指标间的相关性。(2)基础探讨部分：动物实验部分,采取5/6肾切除建立CRF大鼠模型,随机分为6组：假手术组、模型组、尿毒清组、低、中、高剂量益肾降浊冲剂组(分别简称低剂量组、中剂量组、高剂量组)。建模2周后,尿毒清组予以5g/kg/d,低、中、高剂量组分别予以益肾降浊冲剂3g/kg/d、6g/kg/d.9g/kg/d灌胃。用药10周后分别检测肾功能、24h尿蛋白定量,通过HE、PAS、 Masson染色、Terminal deoxynucleotidyl tranerase dUTP nick-end labepng (TUNEL)凋亡法、电镜、ELISA、免疫组化、Western Blot分别观察肾小管间质的损伤程度、肾小管上皮细胞凋亡、线粒体损伤与再生、氧化应激相关指标、TGF-β1及信号蛋白(pp38MAPK、pERKl/2)的表达。细胞实验部分,选择SD雄性大鼠,随机分为5组,即对照组(生理盐水),尿毒清组(5g/kg/d)、低、中、高浓度益肾降浊冲剂组(3g/kg/d、6g/kg/d、9g/kg/d),连续灌胃7d,末次给药1h后,取血、分离含药血清。随机分为6组,空白对照组,lOng/ml TGF-β1干预组,TGF-β1+尿毒清含药血清组,TGF-β1+低、中、高浓度益肾降浊冲剂含药血清组,作用时间48h。通过光镜、台盼蓝染色、TUNEL凋亡法、电镜、JC-1荧光探针、2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯(2',7'-Dichlorofluorescein diacetate, H2DCF-DA)荧光探针、RT-PCR. Western Blot分别观察细胞形态、细胞活性、凋亡率,线粒体结构、功能、再生及动力平衡相关基因、及ROS-MAPK信号通路的变化。结果：(1)临床探讨部分：两组治疗前临床资料比较差别无统计学作用；两组综合治疗疗效比较,总有效率86.45%,其中显效率33.33%；对照组总有效率56.67%,其中显效率12%,试验组总有效率及显效率均优于对照组,与对照组比较P0.05；两组治疗前血肌酐水平与中医症状总积分呈正相关,GFR与血肌酐水平、尿a1-MG、β2-MG、NGAL及尿TGF-β1水平呈负相关,尿a1-MG、β2-MG、 NGAL水平分别与尿TGF-β1水平呈正相关,P0.01；试验组,益肾降浊冲剂治疗12周后,中医临床症状显著改善,中医症状积分显著下降,血肌酐显著降低,GFR显著升高,尿β2-MG、NGAL显著降低,尿TGF-β1显著降低,与治疗前比较P0.05,与对照组比较P0.05,试验组治疗后尿a1-MG有所下降但与治疗前比较无统计学差别。(2)实验探讨部分：动物实验部分,模型组大鼠24h尿蛋白量、BUN、Scr、残肾重/体重显著升高,肾小管间质损伤评分显著升高,胶原染色阳性面积显著增加,肾小管上皮细胞凋亡数显著增加,与假手术组比较(P0.01)；益肾降浊冲剂组呈剂论文导读：Tfam)、过氧化物酶体增殖体激活受体γ共激活体(Peroxisomepropferator-activatedreceptorγco-activator-1α,PGC-1α)的表达,升高超氧岐化酶(superoxidediutase,SOD)的活力及谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,抑制TGF-β1及p-p38MAPK、pERK1/2的表达,与模型组比较(P0.01),中、
量依赖性降低上面陈述的指标,与模型组比较(P0.01),中、高剂量组与尿毒清组比较(P0.01)；益肾降浊冲剂治疗组也呈剂量依赖性恢复大鼠残肾肾小管上皮细胞内线粒体的数目、形态结构,上调线粒体相关再生基因线粒体转录因子A (mitochondrial transcription factor A, Tfam)、过氧化物酶体增殖体激活受体γ共激活体(Peroxisome propferator-activated receptor γ co-activator-1α, PGC-1α)的表达,升高超氧岐化酶(superoxide diutase,SOD)的活力及谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量,降低丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量,抑制TGF-β1及p-p38MAPK、pERK1/2的表达,与模型组比较(P0.01),中、高剂量组与尿毒清组比较(P0.01)。细胞实验部分,益肾降浊冲剂含药血清呈浓度依赖性恢复10ng/ml TGF-β1干预下肾小管上皮细胞(NRK-52E)的活性,呈浓度依赖性抑制TGF-β1诱导下的细胞凋亡、抑制Bax/Bcl-2比,改善线粒体的结构、恢复线粒体膜电位、抑制ROS的产生、上调SOD的活性、上调线粒体融合基因视神经萎缩蛋白(optic atrophy type1,OPA1)的表达、抑制断裂基因即动力相关蛋白-1(dynamin related protein1, DRP1)及断裂基因1(fissionl, Fisl)的表达、恢复再生基因Tfam、PGC-1α的表达,抑制p38MAPK、ERK1/2的磷酸化,与TGF-β1组比较(P0.01),中、高浓度组与尿毒清组比较(P0.01)。结论：(1)益肾降浊冲剂能通过有效降低患者“脾肾气虚、湿浊内蕴”证型患者的尿TGF-β1的水平、减轻肾小管的损伤,进而改善CKD3-4期患者体现为“脾肾气虚、湿浊内蕴”证型的中医临床症状及肾功能。(2) TGF-β1通过ROS-MAPK信号通路影响线粒体的动力平衡与再生基因的表达、转变线粒体膜电位、进而诱导肾小管上皮细胞凋亡是慢性肾功能衰竭大鼠肾小管间质纤维化的重要作用机制。益肾降浊冲剂能通过抑制TGF-β1-ROS-MAPK信号,改善线粒体的动力平衡、再生与功能,进而抑制肾小管上皮细胞凋亡,以而减轻慢‘性肾衰大鼠残肾小管间质的病理损伤,改善慢性肾衰大鼠肾功能、降低尿蛋白。关键词：益肾降浊冲剂论文慢性肾衰竭论文肾小管损伤论文凋亡论文线粒体再生论文线粒体动力平衡论文氧化应激论文TGF-β1论文MAPK信号论文
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Abstract9-13
英文缩略词对照表13-14
前言14-22
第一部分 临床探讨部分22-38
探讨背景22-23
探讨对象与策略23-28

1. 探讨对象23

2. 入选患者标准23-25

3. 分组与给药25-26

4. 观察指标及观察时间26-27

5. 疗效判断标准27-28

6. 统计学策略28

结果28-33

1. 两组基线资料比较28-29

2. 两组综合疗效比较29

3. 两组患者治疗前后临床生化指标比较29-30

4. 两组患者治疗后中医证候疗效比较30

5. 两组患者治疗前后中医临床症状总积分比较30-31

6. 两组患者治疗前后中医主要临床症状积分比较31-32

7. 两组患者治疗前后肾小管损伤相关指标及尿TGF-β1的比较32

8. 各指标间相关性浅析32-33
讨论33-38
第二部分 基础探讨(动物实验+细胞实验)部分38-82
探讨背景38-39
材料与策略39-51

(一)动物实验部分39-46

1. 主要试剂与材料39-40

2. 主要仪器设备40

3. 实验策略40-46

3.1 实验动物模型制作与分组40

3.2 24h尿蛋白定量测定40

3.3 血肌酐、尿素氮40-41

3.4 氧化应激指标SOD、MDA、GSH测定41

3.5 肾脏组织病理学检查41-42

3.6 肾小管损伤评分42

3.7 肾间质胶原沉积面积观察42-43

3.8 TUNEL凋亡检测43

3.9 透射电镜制样与观察步骤43-44

3.10 肾组织免疫组化步骤44-45

3.11 Western Blot策略检测肾组织相关蛋白的表达45-46

4. 统计学策略46

(二)细胞实验部分46-51

1. 主要试剂与材料46-47

2. 主要仪器设备47

3. 实验策略47-51

3.1 含药血清制备47

3.2 鼠肾小管上皮细胞的培养47

3.3 台盼蓝染色检测细胞存活率47-48

3.4 倒置显微镜下观察细胞形态48

3论文导读：
.5 一步法TUNEL检测细胞凋亡48-49

3.6 透射电镜制样与观察步骤49

3.7 线粒体膜电位测定49

3.8 氧化应激相关检测49-50

3.9 RT-PCR策略50-51

3.10 Western Blot策略51

4. 统计学策略51

结果51-73

(一)动物实验部分51-62

1. 生化指标的转变51-52

2. 各组大鼠肾小管间质的病理转变52-55

3. 各组大鼠肾小管上皮细胞的凋亡情况55-57

4. 各组大鼠肾小管上皮细胞线粒体结构的转变57

5. 凋亡相关基因的表达57-58

6. 再生基因蛋白表达58-59

7. 各组大鼠肾小管间质TGF-β1的表达59-60

8. 氧化应激相关产物的表达60-61
9. 信号蛋白的相对表达61-62

(二)细胞实验部分62-73

1. 台盼蓝染色检测细胞活性结果显示62-63

2. 益肾降浊冲剂含药血清对NRK-52E细胞形态的影响63-64

3. 益肾降浊冲剂含药血清对NRK-52E细胞凋亡的影响64-65

4. 益肾降浊冲剂含药血清对NRK-52E细胞线粒体膜电位的影响65-67

5. 益肾降浊冲剂含药血清对NRK-52E细胞线粒体结构的影响67-68

6. 益肾降浊冲剂含药血清对NRK-52E细胞内ROS、SOD产生的影响68-69

7. 线粒体动力平衡相关基因的表达69-70

8. 益肾降浊冲剂含药血清对TGF-β1诱导下细胞Bax、Bcl-2表达的影响70-71
9. 益肾降浊冲剂含药血清对TGF-β1诱导下线粒体再生基因表达的影响71-72
10. 益肾降浊冲剂含药血清对TGF-β1诱导下细胞信号蛋白表达的影响72-73
讨论73-82
结论82-83
参考文献83-90
致谢90-91
文献综述91-97
参考文献95-97
作者简历97-98